汚染された TFA

Q: 私は、不純物および分解物を伴う分析対象試料の検証に関する論文を元に、ある分析法を開発しています。その分析法は、C18カラムを（A）0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液および（B）0.1% TFAの80%アセトニトリル／20%メタノール溶液を使用するグラジエント法です。バッファーとして他の移動相添加物（酢酸、リン酸、リン酸ナトリウム）についても検討しましたが、TFAを使用した結果が最も良いピーク形状および分離度でした。この結果がシラノールの抑制あるいはイオン対によるもの、あるいはこれら両方によるものなのか、良く分かりませんが、次のことを心配しています。

(1）カラムの安定性および（2）移動相中でのTFA自身の安定性です。また、分析対象試料の保持時間の近くでベースラインが大きく乱れることがあります。このベースラインの乱れは通常、気にする程度ではありませんが、その分析法で0.1%以下の濃度の関連化合物を測定しようとすると、定量下限（LLOQ）近くのピークにとっては、問題になってきます。このベースラインの乱れは、いつも生じるわけではなく、新しいバッチの移動相を作成するとその問題は無くなります。（1）TFAを使用しながらカラムの寿命を延ばす方法および（2）TFAの劣化による生じるベースラインの乱れを最小限にする方法について、助言を頂けないでしょうか？

JWD: 最初に、あなたはカラムにダメージを与える様な条件を使用していません。0.1%のTFAを使用するこの方法は、広く使われており、問題の原因にはなりません。0.1%TFAのpHはおおよそ2であり、現在の高純度シリカ（タイプB）カラムはpH2から8の範囲で安定であるため、pHのことで心配することはありません。また、今回のケースで使用している、低いpHと良いイオン対特性というTFAが有する特徴的な組み合わせは、他のバッファーではおそらく成し得ません。

ベースラインが安定しない原因は？

残念ながら、純粋なTFAでも一度、大気に晒されると、安定ではありません。私は、HPLCグレードTFAの1mLアンプルを、一回の測定ごとに購入して使われるのをお勧めします。試薬のカタログを見れれば、25mLあるいは100mLのボトルが1mLアンプル10本とおおよそ同じ値段で購入することが出来ることに気付き、経費を節約しようとすると思いますが、私はこの方法をお勧めしません。私の経験では、大きな容器でも、一回で使用できる時のみにしかお勧めできません。例えば、不活性雰囲気下のグローブバッグ内において容器を開け、使用後にワックスでボトルを密封し、さらにこの他にも保存のための工夫をします。しかし、二回目にボトルを開ける時には毎回、ブランク測定において余分なピークが現れるという様な、汚染があります。ですから、安全策としてTFAをアンプルで購入して下さい。

TFAが移動相内で安定である限り、そこに大きな問題があるとは思っていません。TFAは原液では揮発性が高いですが、一度水溶液となると、TFAはイオン化し、揮発しません。しかし、HPLCに使われる全ての移動相は古くなると劣化します。すると、問題は単に、移動相を長く使おうとし過ぎているだけということでしょう。例えば、図1は調製したばかりの緩衝液（下のクロマトグラム）と長時間の汚染を受けた緩衝液（上のクロマトグラム）を用いた時の、グラジエントベースラインの違いを示しています。私は、水系の移動相は週に一度、調製することをお勧めします。多くの研究者がこの再調製までの期間を特に問題無く2週間に延ばしていますが、私は、なぜあえてリスクを冒すのですか？と聞いてみたいです。もちろん、有機溶媒系移動相は月に一度の調製で構いません。

新しいバッチの移動相を調製する際は、必ずリザーバー容器もきれいなものに交換して下さい。汚れた容器によって、新しいバッチの移動相が汚染されるのは困りますから。そして、2週間以上、水系移動相を使うなどして、もしシステムが汚染されていると思うならば、リザーバー容器内の溶媒フリットを交換することが賢明です。これは、相互汚染の原因の一つにもなります。

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